1928年1月重任总司令职，2月主持国民党二届四中全会，全面改变孙中山的革命政策；会上被举为中央政治委员会主席和军事委员会主席。4月，与冯玉祥、阎锡山、李宗仁组成四个集团军合力北进，战胜了奉系军阀张作霖，结束了北洋军阀的统治。
10月任国民政府主席兼陆海空军总司令，改组国民政府，实行“以党治国”的训政。蒋介石为要确立个人独裁统治的局面，以“裁军建设”相号召，力图“编遣”冯玉祥、阎锡山、李宗仁的军队，加剧了与各军事实力派之间的矛盾，遂至兵戎相见，蒋桂战争、蒋冯战争、蒋阎冯战争连绵不断。蒋介石凭借帝国主义和江浙大资产阶级的支持，一一战胜了各派武力。
1930年12月至1931年9月，蒋介石调集大量军队，对江西、湘鄂西、鄂豫皖及其他革命根据地的工农红军连续发动了三次军事“围剿”，均以失败告终。
1931年5月汪精卫、孙科等人成立广州国民政府和蒋介石南京政府相对抗。
1931年“9·18”事变后，任军事委员会委员长，推行“攘外必先安内”政策，围攻红军革命根据地。
1931年底辞国民政府主席职后，于次年初任军事委员会委员长。
1935年11月，日本帝国主义策动“华北自治”，扩大对中国的侵略，民族危机空前严重。中国共产党呼吁停止内战一致抗日，并将反蒋抗日方针改变为“逼蒋抗日”。在全国人民抗日救亡运动推动下，蒋介石和国民党决定调整其内外政策，表示要保持领土主权的完整。他下令采取一系列措施加强国防建设，并改善同苏联的关系。他试图同中国共产党进行谈判，但仍然坚持要“剿灭”经长征到达陕北的红军。